Немецкий врач и ученый Кох Роберт (1843-1910) получил Нобелевскую премию за свою микробиологическую работу по борьбе с туберкулезом. Он также создал множество основополагающих методов для микробиологических исследований, некоторые из них используются по сей день.
Труд всей жизни
В конце 19-го века такое заболевание, как туберкулез, убивало почти треть всех взрослых людей среднего возраста в Европе. Врачи и ученые того времени делали многочисленные попытки найти лекарство. Кох Роберт не стал исключением, борьба с этим тяжелым недугом стала его миссией, трудом всей его жизни. Несмотря на создание огромного прогресса в идентификации и потенциальном лечении этого заболевания, даже получив Нобелевскую премию по медицине за эту работу, ученый не переставал совершенствовать методы исследования, которые оказали большое влияние на всю микробиологию.
Юность и выбор профессии
Родители будущего ученого были бедными шахтерами, которые были поражены тем, какого способного мальчика им подарила судьба. Рожденный в 1843 году в Клаустале (Германия), Генрих Герман Роберт Кох был в детстве настоящим вундеркиндом. В пять лет он уже читал газеты, а немного позже увлекался классической литературой и был экспертом по шахматам. Интерес к науке проявился еще в средней школе, где в качестве любимого предмета была выбрана биология.
В 1866 году в возрасте 23 лет Генрих Роберт Кох получил степень доктора медицины и провел следующее десятилетие, работая в качестве врача в различных больничных и государственных научных сообществах. В 1876 году он опубликовал свое крупное исследование в области такого заболевания, как сибирская язва, которое принесло ему широкую известность. Несколько лет спустя он был назначен советником в бюро здравоохранения, где большую часть времени он занимался проблемами, связанными с туберкулезом.
Определение причины туберкулеза
Современной медицине известно множество причин большинства заболеваний. Во времена, когда жил Кох Роберт, это знание не было столь распространенным явлением. Одним из первых важных открытий ученого была идентификация микобактерий туберкулеза, которые вызывают это смертельное заболевание. Роберт Кох, изучая причины заражения, намеренно инфицировал морских свинок материалом одного из трех зараженных животных: обезьян, крупного рогатого скота и людей. В итоге было выяснено, что бактерии инфицированных свинок были идентичны тем, которыми они были заражены, вне зависимости от источника инфекции.
Постулаты Коха
Какой внес Роберт Кох вклад в микробиологию? Одним из наиболее влиятельных методов было предложение о том, что возбудитель заболевания мог быть идентифицирован с высокой степенью уверенности при соблюдении четырех условий, которые в последствие стали называть постулатами Коха. Вот они:
- Микроорганизм должен вызывать заболевания у всех организмов, в которых он в изобилии присутствует, следовательно, в неинфицированных организмах их быть не должно.
- Подозреваемый микроб должен быть выделен и выращен в чистом виде.
- Повторное введение микроба должно вызывать заболевания у ранее неинфицированных организмов.
- Подозреваемый микроб должен быть повторно изолирован от тестируемого организма, выращен в чистом виде и быть идентичным первоначально изолированному микробу.
Основатель бактериологии и микробиологии
Среди заболеваний, которые изучал немецкий врач Роберт Кох (сибирская язва в 1876 и туберкулез в 1882), была еще и холера в 1883 году. В 1905 году ученый был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине. Еще будучи студентом-медиком, Генрих Герман Роберт Кох испытывал большой интерес к патологии и инфекционным заболеваниям. В качестве врача он работал во многих небольших городах по всей Германии, а во время франко-прусской войны (1870-1872) вызвался на фронт в качестве военного хирурга.
Позже было назначение участковым медицинским работником, главная обязанность которого было исследование распространения инфекционных бактериальных болезней. Применение биотехнологий в медицине по-прежнему в значительной степени зависит от принципов Коха, закрепляющих причины инфекционных заболеваний. Великий ученый умер в 1910 году в регионе Шварцвальд (Германия), ему было 66 лет.
Изучение сибирской язвы
В то время, когда жил Роберт Кох, сибирская язва была широко распространена среди сельскохозяйственных животных в районе Вёлльштайн. У ученого не было никакого научного оборудования в тот момент, были недоступны библиотеки и контакты с другими научными работниками. Впрочем, это его не останавливало, и он приступил к изучению этого заболевания. Его лабораторией была 4-комнатная квартира, которая была его домом, а его главным оборудованием был подаренный его женой микроскоп.
Ранее возбудителя сибирской язвы были обнаружены бациллы Pollender, Rayer и Davaine, и Кох поставил перед собой цель с научной точки зрения доказать, что эта бацилла на самом деле является причиной заболевания. Он прививал мышей с помощью самодельных деревянных щепок бациллами сибирской язвы, взятыми из селезенки сельскохозяйственных животных, которые умерли от этой болезни. Было обнаружено, что смерть грызунов наступила именно вследствие попадания заразы в кровь животных. Этот факт стал подтверждением выводов других ученых, которые утверждали, что болезнь может передаваться через кровь животных, страдающих от сибирской язвы.
Бациллы сибирской язвы устойчивы к внешней среде
Но это не удовлетворило Коха. Он также хотел знать, могут ли эти микробы вызывать заболевание в случае, если они никогда не были в контакте с любым видом животного организма. Чтобы решить эту проблему, он получил чистые культуры бацилл. Роберт Кох, изучая и фотографируя их, пришел к выводу, что при неблагоприятных условиях они производят споры, способные противостоять недостатку кислорода, и другим негативным для бактерий факторам. Таким образом они могут выживать во внешней среде довольно продолжительное время, а когда подходящие условия будут созданы, их жизненные силы восстанавливаются, из спор выходят бациллы, способные заражать живые организмы, в которые они попадают, несмотря на то, что прежде у них не было никакого контакта с ними.
Роберт Кох: открытия и достижения
Результаты кропотливой работы по изучению сибирской язвы были продемонстрированы Кохом Фердинанду Кону, профессору ботаники в университете Бреслау, который собрал своих коллег, чтобы засвидетельствовать это открытие. Среди присутствующих был также профессор анатомических патологий Конхайм. Все были глубоко впечатлены работой Коха, а после публикации работы в ботаническом журнале на эту тему в 1876, Кох сразу стал знаменитым. Он продолжал, тем не менее, работать на Вёлльштайн еще в течение четырех лет, и за этот период времени он улучшил свои методы фиксации, окрашивая и фотографируя бактерии.
Жизнь в Берлине
Позже, уже в Берлине, он продолжает совершенствовать бактериологические методы, а также изобретать новые - выращивание чистых бактерий в твердых средах, таких как картофель. Область, в которой продолжал работать Роберт Кох, микробиология, до последнего оставалась его узкой специальностью. Он также разработал новые методы окрашивания бактерий, которые сделали их более заметными и помогали их идентифицировать. Результатом всей этой работы стало внедрение методов, с помощью которых патогенные бактерии могут быть просто и легко получены в чистой культуре, свободных от других организмов и с помощью которых они могут быть обнаружены и идентифицированы. Спустя два года после прибытия в Берлин Кох открыл туберкулезную палочку, а также способ выращивания её в чистом виде.
Борьба с холерой
Кох все еще был занят работой по борьбе с туберкулезом, когда в 1883 году он был отправлен в Египет в качестве лидера комиссии от Германии для расследования вспышки холеры в этой стране. Здесь он обнаружил вибрион, который вызывает заболевание и принес чистые культуры в Германию. Аналогичным вопросом он занимался также в Индии. На основе его знаний о биологии и способе распространения холерного вибриона, ученым были сформулированы правила для борьбы с эпидемией, которые были одобрены великими державами в Дрездене в 1893 году и легли в основу методов контроля, которые используются до сих пор.
Назначение на высокие должности
В 1885 году Роберт Кох, биография которого берет свое начало с маленького городка и мало обеспеченной семьи, был назначен профессором гигиены в Берлинском университете. В 1890 году он был назначен генеральным хирургом, а в 1891 году он стал почетным профессором медицинского факультета и директором нового института инфекционных заболеваний. В этот период Кох вернулся к своей работе по борьбе с туберкулезом. Он пытался остановить заболевание с помощью препарата, который он назвал туберкулин, созданный из микобактерий. Было создано две версии препарата. Первая из которых моментально вызвала значительные споры. К сожалению, целебная сила этого препарата была сильно преувеличена, и возложенные на него надежды не оправдались. Новый туберкулин (вторая версия) был объявлен Кохом в 1896 году, и его лечебное значение также стало разочарованием, но, тем не менее, это привело к открытию веществ диагностической ценности.
А далее чума, малярия, трипаносомоз...
В 1896 году Кох отправился в Южную Африку для изучения происхождение чумы крупного рогатого скота. Несмотря на то, что причину этой болезни выяснить не удалось, ограничить вспышку все же получилось. Затем последовала работа в Индии и Африке по малярии, лихорадка Блэкуотер, трипаносомоз и чума крупного рогатого скота и лошадей. Публикация его наблюдений по этим заболеваниям была в 1898. Вскоре после его возвращения в Германию, путешествия по миру продолжились. На этот раз это была Италия, где он подтвердил работу сэра Рональда Росса касательно малярии и выполнил полезную работу по этиологии различных форм малярии и борьбы с ними при помощи хинина.
Вклад в микробиологию: почетные премии и медали
Именно в эти последние годы своей жизни, Кох пришел к выводу, что бациллы, вызывающие туберкулез человека и крупного рогатого скота, не являются идентичными. Его утверждение на Международном медицинском конгрессе по борьбе с туберкулезом в Лондоне в 1901 году вызвало много споров, но в настоящее время известно, что точка зрения Коха была правильной. Его работа над тифом привела к идее, что эта болезнь передается гораздо чаще от человека к человеку, чем от питьевой воды, и это привело к новым мерам контроля.
В декабре 1904 года Кох был направлен в Восточную Африку для изучения лихорадки крупного рогатого скота, где он сделал важные наблюдения не только этой болезни, но патогенных видов Babesia и Trypanosoma и tickborne spirochaetosis. Профессор Роберт Кох был удостоен многих премий и медалей, почетное членство в научных сообществах и академиях в Берлине, Вене, Неаполе, Нью-Йорке и других. Он был награжден Немецким орденом Короны, Большим крестом немецкого ордена Красного Орла. В ряде стран были установлены мемориалы и памятники в честь великого микробиолога. Доктор Кох умер 27 мая 1910 года в Баден-Бадене.
Германия производила на свет много новаторских научных умов на протяжении многих веков, одним из величайших ученых своего времени можно по праву назвать Роберта Генриха Германа Коха, который заложил основу для изучения бактериологии, а также помог в объяснении причин и возможных методов лечения различных бактериальных заболеваний.
Он был бесстрашным исследователем, так как отвечал за проведение беспрецедентных мероприятий по изучению таких угрожающих жизни заболеваний, как сибирская язва, туберкулез и многие другие. Этот эрудированный ученый также сыграл важную роль в создании современных лабораторий. Кох Роберт был не просто одаренный ученый, это был гений, и то количество наград и медалей, которые он получал на протяжении всей своей жизни, служит лучшим доказательством того вклада, который он сделал в мировую медицинскую науку.
22. Методы выделения чистых культур аэробов.
Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.
Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму или другим методом и микрсгскопиру-ют. Для посева исследуемый материал в случае необходимости разводят в пробирке со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Одну каплю приготовленного разведения наносят петлей на поверхность питательного агара в чашку Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно распределяя материал по всей ее поверхности. После посева чашку переворачивают дном кверху, подписывают и помещают в термостат при температуре 37 °С на 18-24 ч.
Второй этап. Просматривают чашки и изучают изолированные колонии, обращая внимание на их форму, величину, консистенцию и другие признаки. Для определения морфологии клеток и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для выделения и накопления чистой культуры одну изолированную колонию или несколько различных изолированных колоний пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии.
Третий этап: Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нем обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Очнако в случае выраженного полиморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры наряду с типичными встречаются и другие формы клеток.
23. Методы выделения чистых культур анаэробов.
Питательные среды для анаэробов должны отвечать следующим основным требованиям: 1) удовлетворять питательным потребностям; 2) обеспечивать быстрый рост микроорганизмов; 3) быть адекватно редуцированными
Посевы с целью выделения анаэробной микрофлоры, как спо-рообразующей (клостридии), так и неспорообразующей (вейлонеллы, бактероиды, пептококки), производят в строго анаэробных условиях. Первичные посевы делают на обогатительные среды (тиогликолевую, Китта - Тароцци), затем пересевают на плотные среды: сахарный кровяной агар в чашки Петри, в высокий столбик сахарного питательного агара или другие среды для получения изолированных колоний. После инкубации посевов в анаэробных условиях из образовавшихся колоний бактерий готовят мазки, окрашивают, микроскопируют, а затем пересевают на среду Китта - Тароцци и агаровые среды для выделения чистой культуры.
При выделении спорообразующих анаэробных бактерий (клостридии) первоначальные посевы прогревают на водяной бане при температуре 80 °С в течение 20 мин для уничтожения вегетативных клеток посторонней микрофлоры, которая может присутствовать в исследуемом материале
24. Идентификация микроорганизмов морфологическая, культуральная серологическая, биологическая, генетическая.
Идентификация – это определение систематического положения, выделение из какого-либо источника до уровня вида или варианта.
25. Биохимический метод идентификации: определение протеолитических. сахаролитических, липолитических свойств, выявление гемолизинов и оксидоредуктаз. Использование автоматических микробиологических анализаторов .
Этот метод предусматривает изучение ферментативной деградации различных субстратов (углеводов, аминокислот и белков, мочевины, перекиси водорода и др.) с образованием промежуточных и конечных
продуктов.
Карбогидразы - ферменты, разлагающие углеводы. Определяя карбогидразы, выявляют т.н. сахаролитические свойства микробов. С этой целью используют следующие среды:
а) среды Гисса (жидкие и полужидкие с индикаторами). В качестве последних используют реактив Андреде, бромтимоловый синий или ВР О ферментативной активности бактерий судят по изменению цвета среды и образованию газа;
б) дифференциально-диагностические среды с лактозой (Эндо, Левина. Плоскирева и др.);
в) полиуглеводные среды (типа Олькеницкого, Клиглера и др.).
Протеазы -ферменты, разлагающие белки:
а) исследуемая культура может расщеплять белки субстрата с образованием пептона, альбумоз, аминокислот. Этот процесс идет за счет ферментов-протеиназ и пептидаз. Для выявления указанных ферментов исследуемую культуру засевают на ряд сред: свернутая сыворотка, столбик желатина (разжижение в положительных случаях), молочный агар в чашке Петри (в положительных случаях вокруг колоний появляются зоны помутнения);
б)расщепление аминокислот микробами может идти путем декарбоксилирования, либо путем дезаминирования. В первом случае из той или иной аминокислоты образуются амины, которые выявляются либо методом элекрофореза. либо по подщелачиванию среды. О наличии дезаминаз у микроба судят по образованию аммиака в среде как результат процесса дезаминирования аминокислоты;
в) расщепление аминокислоты триптафана за счет действия фермента триптафаназы сопровождается образованием индола. Последний выявляется с помощью бумажки, смоченной щавелевой кислотой и укрепленной под пробкой над питательной средой. В положительныхслучаях бумажка краснеет;
г) для выявления ферментов расщепления серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин) ставят пробы на H2S, как Продукт расщепления этих аминокислот десульфуразами. Наличие H2S выявляется и в среде Олькеницкого;
д) для выявления уреазы - фермента, расщепляющего мочевину, в питательную среду нейтральной рН добавляют мочевину и индикатор. В положительных случаях среда изменяет цвет за счет сдвига рН в щелочную сторону в связи с образованием аммиака. Липазы - ферменты разложения липидов и липоидов. Чаще всего определяют лецитиназу посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид. В этих случаях при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность.
Ферменты-токсины : Гемолизины - ферменты расщепления фосфолипидной мембраны эритроцитов. Они выявляются посевом культуры на кровяной агар (5-10%). Различают b-гемолиз или полный гемолиз, когда образуются зоны просветления вокруг колоний, а-гемолиз, неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как д-гемолиз.
Цитотоксины - ферменты, оказывающие токсический эффект на клетки мишени. Например, цитотоксичность токсина анаэробных микрорганизмов определяют на культуре клеток. С этой целью 1 г материала (испражнения или др.) разводят в фосфатном буфере 1:10 масса/объем, центрифугируют ЗО мин при 4ООО об/мин. Супернатант фильтруют на фильтре 2О нм, вносят в монослой культуры клеток МакКоя и инкубируют при 37°С 24-48 часов до достижения токсического эффекта.
Иммунохимическое определение продукции токсинов: используется, как правило, иммуноферментный метод определения многих экзотоксинов -дифтерийного, холерного, стафилококкового и др. Для этого применяются тест-системы на основе моноклональных антител к определенному экзотоксину.
Ппазмокоагулаза - фермент, свертывающий плазму крови животных. Определяют в пробирочной реакции. В1 мл цитратной плазмы кролика или человека (цельной или разведенной в 2 и 4 раза физраствором) размешивают петлю суточной агаровой культуры микроба. Смесь инкубируют в термостате при 37°С. В положительных случаях через 2-4 часа плазма свертывается (появляется сгусток). Лецитиназа - см. выше.
Оксидо-редуктазы:
1. Определение оксидаз . На фильтровальную бумагу, смоченную 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина, петлей наносят полосы испытуемой культуры. В положительном случае появляется фиолетовое окрашивание полос (в течение 1 мин).
2. Определение каталазы . Каплю 3% раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и туда вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки кислорода.
3. Определение дегидраз . О наличии дегидраз судят по редуцирующей способности микроба, т.е. способности восстанавливать некоторые органические красители (например, 1% водный раствор метиленовой синьки). К столбику сахарного агара (донатор водорода) добавляют краситель (акцептор водорода) и засевают микробную культуру уколом. В положительных случаях растущий на такой среде микроб ее обесцвечивает.
4. Определение спектра короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), Анаэробные микроорганизмы продуцируют промежуточные продукты, включающие короткоцепочечные жирные кислоты и спирты, спектр (профиль) которых различен у разных видов микроорганизмов и позволяет проводить идентификацию микроорганизмов до уровня рода. Наиболее часто исследуют уксусную, пропионовую, бутиловую, изобутиловую, валериановую, изовалериановую, капроновую и изокапроновую кислоты. Для определения КЦЖК используют метод газожидкостной хроматографии. Идентифицируют такие микроорганизмы как актиномицеты, пролионибактерии, эубактерии, бифидобактерии, клостридии.
В последние годы а бактериологических лабораториях применяются коммерческие тест-системы для быстрой биохимической идентификации (определение биохимической активности разных групп микроорганизмов): например, 2О тестов для энтеробактэрий и ЗО тестов для анаэробов. Схема идентификации включает следующие этапы:
Колонии ---- Приготовление ---- Внесение ----- Инкубация ---- Учет(+ -) ---- Интер-
суспензии суспензии 4 часа 37°С претация в среду
В качестве материала для идентификации используют хорошо изолированную колонию на чашке или чистую культуру в пробирке, из которой готовят суспензию в концентрации стандарта оптической плотности N4, затем по 55 мкл суспензии вносят в лунки со средами данной тест-системы. Планшета со стрипами инкубируется при 37°С 4 часа. Учет может осуществляться автоматически (используя прибор "АТВ") или визуально Результат биохимической реакции оценивают в виде "+" или "-" и вносят о референс-таблицу, в которой положительному результату соответствует численное выражение, в результате чего получается определенный числовой профиль, соответствующий специапьно разработанному индексу аналитического профиля, позволяющему быстро идентифицировать тот ипи иной
микроорганизм.
Чистой культурой считается совокупность микроорганизмов, принадлежащих к одному виду. Получение данного материала является необходимым моментом исследования в выполнении лабораторных диагностических методик. Для выделения чистых культур бактерий используют мазки из крови, мокроты, фекалий, исследуют гнойный, а также другой биологический материал. В естественных условиях (в воздухе, воде, почве), продуктах пищевого назначения, в трупах (человеческих, животных) содержатся ассоциации различных видов микроорганизмов.
Отделение чистой культуры важно для подробного изучения свойств микробов: морфологических, культуральных, биохимических, а также антигенных. По результатам данных методик исследования можно установить принадлежность возбудителя к определенному виду и типу, иными словами, выполнить его идентификацию.
Принципы биологического разъединения бактерий подразумевают учет особенностей жизнедеятельности микробов с целью выбрать наиболее оптимальные методы исследования. Выбранные методы должны соответствовать возбудителю по определенным параметрам.
- Тип дыхания. Среди бактерий выделяют группы аэробных и анаэробных представителей. Для получения анаэробных микробов материал для исследования прогревают. Следующий этап – культивирование микроба в анаэробных условиях. Методики получения аэробных и анаэробных бактерий различны.
- Спорообразование. Способность некоторых бактерий к спорообразованию обеспечивает защиту и сохранность микроорганизмов.
- Устойчивость бактерий к агрессивному воздействию щелочей и кислот. Устойчивость некоторых видов бактерий к данным веществам обеспечивает максимальное очищение исследуемого материала от примеси других бактерий с применением растворов щелочи либо кислоты.
- Подвижность бактериальных организмов. Для отделения чистой культуры подвижных микроорганизмов используются методы отделения культур микробов в капле конденсата.
- Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам, некоторым химическим веществам и другим антимикробным средствам. Для некоторых возбудителей наиболее предпочтительны методы выделения культур с применением селективных (специфических) питательных сред.
- Антибиотики. Очищают материал от дополнительных микроорганизмов.
- Способность бактерий проникать сквозь неповрежденные кожные покровы. Это свойство присуще некоторым разновидностям, которые обладают факторами агрессии.
- Чувствительность животных к некоторым болезням инфекционного генеза.
Методики проведения оценки возбудителя
Для получения чистых культур бактериальных клеток применяется ряд методов. Каждый из них применяется в той или иной ситуации и имеет последовательные четкие этапы получения колоний возбудителя заболевания. Рассмотрим наиболее популярные.
Методика Пастера
Представляет собой разведение чистых культур в среде для бактериального роста (жидкой консистенции) до получения концентрации с 1 клеткой на объем жидкости. Данный метод выделения имеет важнейшее историческое значение.
Методика Коха
Известна также как методика «пластинчатых разводок». Представляет собой разведение материала для исследования в агаре (в расплавленном состоянии с температурой 48-50°С). Далее полученный состав разливают по чашкам Петри, где он должен застыть.
Посевы обычно проводят с 3-4 последних разведений, так как бактерий там уже мало. Таким образом, при росте микробов на питательной среде проявляются обособленные колонии микроорганизмов, которые рождаются из единственной материнской клетки. Затем из глубины агара можно выбрать изолированную колонию, и пересеять ее на свежую питательную среду. Следующий этап – идентификация и выделение возбудителя.
Методика Шукевича
Используется при необходимости выделить чистую культуру аэробов протея либо каких-либо других микробов, характеризующихся «ползучим» ростом. Сеют культуры на воду, конденсированную у основания скошенного агара.
При данном методе отделения чистой культуры подвижные клеточные организмы (протей) поднимаются на верхушку скошенного агара, а неподвижные формы не меняют своего расположения на среде посева. Путем пересевания верхних краев проросшей культуры, можно вывести чистую бактериальную культуру.
Методика Дригальского
Способ Дригальского довольно широко используется в исследовании биологического материала путем разведения культур в пробирке с бульоном либо с физиологическим раствором.
Следующий этап: одну каплю полученного раствора при помощи стерильного шпателя из стекла распределяют равномерно по поверхности среды питания в 1-ой чашке. Потом, не прожигая шпатель на огне, делают им же посев на 2-ой и 3-ей чаше. Суть метода Дригальского заключается в том, что с каждым последующим посевом культур концентрация бактерий (аэробов) все меньше. На 3-ей чашке они распределяются довольно обособленно, каждая бактериальная клетка при этом дает клональные клетки (в виде изолированной колонии). Их пересевают на скошенный агар для накопления возбудителей.
Методика Вейнберга
Определенные затруднения вызывает выделение чистых культур анаэробных возбудителей, если микроорганизмы не гибнут при контакте с кислородными молекулами. Суть методики заключается в выведении анаэробных микробов (в составе материала) в слегка остывшей (45-50°С) расплавленной среде питания (агарозированной). Проводят 6-10 разведений. Затем идет следующий этап: необходимо быстро охладить состав в пробирке и залить ее поверхность смесью из масла вазелина и парафина, что препятствует проникновению воздуха и способствует развитию анаэробных условий.
При благоприятном посеве прорастают изолированные колонии на второй день, которые можно извлечь из пробирки путем ее нагревания при помощи горелки. Из разрезанного агарового столбика петлей набирают культуры для дальнейшего исследования. Полученные колонии размещают в жидкую питательную среду, на чем этапы выделения колонии анаэробных возбудителей можно завершить.
Методика Хангейта
Ее часто применяют для выделения аэробных микробов, обладающих высокой кислородочувствительностью. В проведении такого выделения культуры аэробов применяется методика вращения пробирок.
Методы засевания аэробных бактерий предполагают выведение их на агаризированной расплавленной среде. Наличие инертного газа в пробирке дает возможность вырастить изолированные колонны аэробных бактерий таким образом, что выделенные культуры аэробов хорошо можно увидеть даже невооруженным глазом на 2-3 день.
Микроманипулятор
Это методика выделения отдельных бактериальных клеток путем применения микроманипулятора. Микроманипулятор представляет собой специальный прибор, которым можно выловить из суспензии одну клетку, а также обеспечить возможность посева культуры в пробирку.
Дальнейшая идентификация возбудителя проводится с учетом всех перечисленных свойств возбудителя (аэробов и анаэробов), а также особенностей их взаимодействия с различными веществами.
В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в 1 дозе исследуемого препарата) по 0,1 мл микробной суспензии высевают на чашки Петри с питательной средой (по 2 чашки на каждое разведение). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского или с помощью стеклянных бус до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации.
Посевы инкубируют при температуре (37 1) о С в течение 24–96 ч в адекватных, в зависимости от вида микроорганизма, условиях (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных). При инкубировании в анаэробных или микроаэрофильных условиях чашки Петри с посевами помещают в анаэростат и создают необходимую газовую атмосферу.
Данный метод может быть использован при определении количества живых бактерий каждого вида в поликомпонентных пробиотиках при условии, что бактерии, входящие в состав препарата, образуют визуально различимые по форме и другим признакам колонии.
1.2. Глубинный чашечный метод
В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в исследуемом препарате) по 1,0 мл микробной суспензии стерильной пипеткой вместимостью 1,0 мл вносят в чашки Петри диаметром 90 мм (по 2 чашки на каждое разведение). Добавляют 20–25 мл расплавленной и охлажденной до температуры 42,5 ± 2,5 о С агаризованной питательной среды, закрывают и быстро осторожно перемешивают вращательно-поступательными движениями, не отрывая дна чашки от поверхности стола и не допуская попадания среды на крышку чашки. После застывания агара чашки Петри переворачивают вверх дном и инкубируют в адекватных условиях при температуре (37 1) о С в течение необходимого для данного микроорганизма времени.
Учет результатов
По окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе испытуемого образца. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний.
Пример расчета содержания живых микробных клеток в 1 дозе испытуемого образца:
– из разведения 10 -7 выросло 42 и 45 колоний; среднее арифметическое равно (42+45) : 2 = 43,5;
– из разведения 10 -6 выросло 410 и 450 колоний; среднее арифметическое равно (410+450) : 2 = 430;
– количество живых бактерий в 1 дозе равно:
(43,5 ∙ 10 7 + 430 ∙ 10 6) : 2 10 = 4325000000 = 4,3 ∙ 10 9 .
Умножают среднюю арифметическую числа колоний на степень разведения и в том случае, если высев на чашку Петри сделан в объеме 0,1 мл, умножают на коэффициент 10 для пересчета на 1,0 мл.
Метод предельных разведений с последующим высевом на жидкие и полужидкие питательные среды
Пробирочный метод наиболее вероятных чисел (определение количества живых ацидофильных лактобактерий)
В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца 10 -6 , 10 -7 , 10 -8 , 10 -9 (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии от каждого разведения в 2 пробирки с 9 мл стерильного обезжиренного молока. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение 10 -6 препарата в 0,9 % растворе натрия хлорида соответствует разведению 10 -6 в молоке. Для контроля среды добавляют 4 незасеянные пробирки с молоком. Засеянные и контрольные пробирки инкубируют при температуре (38 1) 0 С в течение 3–4 сут.
По окончании инкубацииопределяют количество пробирок со свернувшимся молоком. Из сгустка с культурой готовят мазки и окрашивают по Граму. Если в мазках видны характерные бактерии и отсутствует посторонняя микрофлора, то данное разведение учитывают, как содержащее микроорганизмы данного вида. В случае сквашивания молока в контрольных пробирках и при обнаружении посторонней микрофлоры в мазках, контроль проводят на новой партии среды.
Учет результатов
При подсчете количества живых особей используют таблицу Мак-Креди (табл. 1). Сначала составляют числовую характеристику. Она состоит из 3 цифр: на первое место (слева) ставят цифру, равную числу пробирок со свернувшимся молоком, взятых в том последнем разведении, где молоко свернулось во всех пробирках (например, 2 пробирки разведения 10 -6).
Следующие две цифры обозначают число пробирок со свернувшимся молоком в 2 последующих разведениях (например, в 1 пробирке разведения 10 -7 и в 1 пробирке разведения 10 -8).
Числовая характеристика результата будет 211.
По таблице Мак-Креди находят вероятное число, соответствующее полученной цифровой характеристике (в нашем случае 13), умножают его на разведение, которому соответствует первая цифра числовой характеристики (в данном примере – 10 -6). Тогда количество живых особей микроорганизмов в 1 дозе составляет 13 ∙ 10 6 = 1,3 ∙ 10 7 .
Таблица 1 Таблица Мак-Креди, используемая при подсчете количества живых ацидофильных лактобактерий
|
Числовая характеристика |
Наиболее вероятное число микроорганизмов при посеве в 2 параллельные пробирки |
8. Методы выделения чистых культур микроорганизмов
Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной среды, сильно зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования микроорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях.
Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов:
а) методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;
б) методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов.
Методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов
Рассев шпателем по Дригальскому . Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й - минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма.
Метод Пастера (метод разведений). Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 1 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число - количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала).
Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды Метод Коха (метод заливок). Исследуемый материал в небольшом количестве вносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С МПА, перемешивают, затем каплю питательной среды с разведенным материалом переносят во вторую пробирку с расплавленным МПА и т.д. Количество разведений зависит от предполагаемой численности микроорганизмов в исследуемом материале. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.
Рассев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый материал петлей вносят в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведенные растворы смешанной культуры на поверхность твердых сред в чашках.
Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержащихся микроорганизмов по величине. Этот метод применяется главным образом для очистки вирусов от бактерий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин).
Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов
Создание оптимальных условий для размножения
Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С).
Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО 2 (кампилобактер, геликобактер).
Метод обогащения. Исследуемый материал засевают на элективные питательные среды, способствующие росту определенного вида микроорганизмов.
Метод Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру. Так, для выделения культуры Proteus vulgaris, Clostridium tetani материал засевают в конденсационную воду на дне пробирки со скошенной плотной средой, не касаясь поверхности среды. Названные микроорганизмы способны давать ползучий рост (роение) на поверхности среды. Сопутствующие микробы растут в нижней части питательной среды, а протей и столбнячный микроб в виде пленки распространяются вверх и занимают всю скошенную часть агара.
Метод прогревания. Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 мин. При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают.
Бактериостатический метод (метод ингибирования). Основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Определенные вещества угнетают рост одних микроорганизмов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные. Смесь пенициллина и стрептомицина позволяет освободить нитчатые грибы и дрожжи от бактериальной флоры. Серная кислота (5% раствор) быстро убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях. Необходимо учитывать, что селективные факторы часто включены в состав среды в бактериостатических концентрациях, поэтому сопутствующие микрооорганизмы остаются жизнеспособными и при переносе колоний исследуемой культуры на обычные среды могут быть причиной получения смешанной культуры.
Загрузка...